Dutina uvnitř protoplastu, která u dospělých buněk zaujímá 30 až 90 % jejich objemu. Je ohraničená na svém povrchu membránou zvanou tonoplast. Tonoplast je součástí endomembránového systému buňky a odděluje vnitřní prostor vakuoly od cytoplasmy; zároveň reguluje transport látek mezi cytoplasmou a vnitřkem vakuoly. Vnitřek vakuoly je vyplněn buněčnou šťávou. Buněčná šťáva je vodný roztok mnoha látek. Složení buněčné šťávy je velmi rozmanité a závisí na typu buňky, taxonomické příslušnosti rostliny, na stáří buňky a na jejím aktuálním fyziologickém stavu. Některé ze složek buněčné šťávy jsou přítomny běžně ve všech vakuolách, jiné se vyskytují jenom v určitých typech vakuol. Někdy se mohou ve vakuolách vyskytovat i látky v pevném stavu (např. krystaly šťavelanu vápenatého). Rozmanité složení vakuolárního obsahu odráží i rozmanitost funkcí vakuol. Některé ze složek buněčné šťávy mohou být transportovány v obou směrech, a to podle aktuálních potřeb buňky. Jiné jsou transportovány pouze jednosměrně, a to do vakuoly. Obsah některých látek vykazuje sezónní změny - např. ukládání rozpustných rezervních cukrů v zásobních orgánech (oddencích, hlízách, bulvách) na konci vegetační sezóny a jejich odběr z vakuoly při jarním rašení.